Opis:
Lipopolisacharyd (LPS) jest składnikiem ściany bakterii Gram-ujemnych silnie aktywującym monocyty i makrofagi wywołąc ogólnoustrojowy stan zapalny, tzw. posocznicę (sepsę). Cząsteczki LPS wiążą się do błony komórkowej leukocytów poprzez białko CD14, które “przekazuje” LPS receptorowi TLR4, który uruchamia ścieżki sygnałowe prowadzące do syntezy cytokin prozapalnych takich jak TNF alpha. Jednocześnie, LPS stymuluje adhezję monocytów do ścian naczyń krwionośnych i ich przechodzenie pomiędzy komórkami endotelium, “przywołując” komórki do miejsc infekcji. Istotnym elementem ścieżek sygnałowych uruchamianych w makrofagach przez LPS jest fosfatydyloinozytol PIP2. Istnieją przesłanki, że PIP2 (i) wiąże białko adaptorowe receptora TLR4, tzw. Mal, uruchamiające kaskadę sygnałową prowadzącą do produkcji cytokin prozapalnych; (ii) kontroluje reorganizację cytoszkieletu umożliwiającą migrację komórek w kierunku źródła LPS; (iii) kontroluje internalizację LPS.

Cel:
Celem pracy doktorskiej będzie zbadanie mechanizmów generacji PIP2 w czasie aktywacji komórek przez LPS, to jest określenie udziału w tym procesie PIP5-kinazy Ialpha i Igamma, głównych kinaz syntetyzujących PIP2 w komórce. W tym celu planujemy wyciszyć ekspresję genów kodujących te kinazy przy użyciu małych, interferujących RNA (siRNA) oraz przeprowadzić przejściową nadekpresję PIP5-kinazy Ialpha-HA oraz PIP5-kinazy Igamma-HA. Aby określić rolę PIP5-kinazy Ialpha i Igamma w procesach inicjowanych przez LPS w opisanych komórkach zbadamy: – zmiany poziomu PIP2 oraz F-aktyny w całych komórkach oraz izolowanej frakcji mikrodomen sfingolipidowo-cholesterolowych; lokalizację PIP5-kinazy Ialpha i Igamma; – polaryzację komórek, ruffling i migrację komórek; stopień ufosforylowania kinazy FAK i paksyliny i ezryny, wskaźników reorganizacji cytoszkieletu związanego z adhezją i migracją komórek; – fosforylację kinaz ERK, p38 i JNK oraz syntezę cytokin (TNFalpha, interferon beta,) jako mierniki udziału PIP5-kinazy Ialpha i Igamma w ścieżkach sygnałowych aktywowanych przez LPS. W poszukiwaniu mechanizmów, przez które zmiany poziomu PIP2 mogą wpływać na organizację cytoszkieletu aktynowego w komórkach aktywowanych przez LPS zbadamy czy zmiany poziomu ekspresji PIP5-kinazy Ialpha i Igamma w komórce wpłyną na aktywność GTPaz z rodziny Rho. Oczekujemy, że przedstawiony cykl badań umożliwi określenie udziału kinaz syntetyzujących PIP2 w odpowiedzi makrofagów na LPS.

Wymagania:
1. Przygotowanie z zakresu biologii komórki i biochemii; 2. Zainteresowanie zagadnieniami biologii komórki; 3. Gotowość podejmowania nowych wyzwań, elastyczność myślenia; 4. Znajomość technik biologii molekularnej. 5. Znajomość języka angielskiego.